如何快速评估16S rRNA基因引物的覆盖率及特异性
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背景
无论是在进行细菌、古菌高通量测序前，还是细菌、古菌qPCR前，最纠结的问题永远是引物选择。评估引物效果最重要的两个指标是覆盖率（coverage）和特异性（specificity）。简单讲，覆盖率就是指目标引物能捕获现有数据库中靶序列的比例，比如，共有100种细菌的不同16S rRNA基因序列，某引物能扩增出其中的90种，那么该引物的覆盖率就是90%；特异性是指目标引物是否只靶标某特定类群，比如，某古菌引物PCR获得的序列全部为古菌，没有任何细菌或其他非古菌序列，则其特异性为100%。本文将介绍一款超级简单、快速、准确地评估16S rRNA基因引物覆盖率及特异性的工具。
TestPrime
该工具是SILVA官网发布的一款在线工具，名为TestPrime 1.0，其网址为：https://www.arb-silva.de/search/testprime/，打开网址后其界面如下图1。由图可知，主要包括四部分：①Sequence Data，需要将待检测的Forward Primer及Reverse Primer序列分别按照5'--3'的方向在此输入；②Database，在此选择合适的数据库及比对序列，一般默认为SILVA最新释放版本（目前为r132）的非冗余参考序列（RefNR）；③Mismatches，可设置所允许的引物最大错配数及3'端0错配的长度；④Job name，可给当前任务命名。
图1. TestPrime 1.0的主界面
使用
将待检测的Forward Primer及Reverse Primer序列分别按照5'--3'的方向输入上图“Sequence Data”部分对应文本框中→在“Database”处选择合适的数据库及比对序列→在“Mismatches”处，设置所能允许的引物错配值→在“Job name”处填写此次任务名→点击界面右下角“Run TestPrime”→静待片刻（依网速几分钟到十几分钟），收获结果。
运行结束后，可在页面下方的“TestPrime Tasks”看到类似图2所示界面，点击红色箭头处“show result”，即可跳转至相应任务的结果页面。
下拉页面即可看到不同的结果展示内容，主要包括“Overview (all domains)”、“Table of Matched Accessions per Taxonomy”、“Table of Matched Regions”三部分内容（图3）。其中“Table of Matched Accessions per Taxonomy”部分（图3红框标出）就包含引物与SILVA数据库比对后的各分类级别（domain到genus）的覆盖率及特异性等信息。点击左下角“Export Table to CSV”即可导出CSV格式结果数据，用Excel打开文件即可。
图3. TestPrime运行结果示例
示例
现以Walters et al. (2016)文章提到的两对常用细菌&古菌通用引物为例（表1），比较新旧引物的覆盖率变化。Walters等在其文章中提到，相比最初的引物515f Original+806r Original，各改变一个碱基后的新引物515f Modified+806r Modified会显著提高对细菌SAR11 clade和古菌Thaumarchaeota的覆盖率。这个结论能否通过TestPrime再现呢？
我们分别将两对新旧引物（见表1）通过TestPrime检测其覆盖率，从输出结果中分别将两对引物对总细菌、古菌及所关注的细菌SAR11 clade和古菌Thaumarchaeota的覆盖率整理为表2，可发现：新引物对（515fM+806rM）相比旧引物对（515fO+806rO）在0错配（0mis）情况下，虽然对总Bacteria的覆盖率仅由86.8%提高至87.7%，但对细菌SAR11 clade的覆盖率从原来的1.5%显著提高至96.1%！对总Archaea的覆盖率从原来的52.9%显著提高至85.7%，尤其是对古菌Thaumarchaeota从原来0.5%提高至91.8%！因此，通过TestPrime依据SILVA数据库的引物检测结果与Walters等在其文章中提到的结果一致！
表1. 细菌&古菌通用引物列表
表2. TestPrime检测细菌&古菌新、旧通用引物结果中摘录的部分类群覆盖率
更多
1. 图1“Database”处，可选择SSU（16S / 18S）或LSU（23S / 28S），因此，TestPrime除了量化检测16S rRNA基因引物的覆盖率、特异性等，还可以检测18S、23S或28S相关的引物对。
2. 对于SSU / LSU相关的探针或单引物的覆盖度及特异性检测，可用SILVA开发的另一款在线工具TestProbe 3.0（https://www.arb-silva.de/search/testprobe/probe），用法类似，不再赘述。
3. 更详细的教程及更多的引物评估相关参数请参见官网说明：https://www.arb-silva.de/documentation/testprime-tutorial/
4. 引物真实效果与多种因素相关，通过数据库来看覆盖率和特异性只是其中重要一方面，真实效果要合成引物后结合实际实验去验证。
参考文献
Apprill A, McNally S, Parsons R, et al. Minor revision to V4 region SSU rRNA 806R gene primer greatly increases detection of SAR11 bacterioplankton[J]. Aquatic Microbial Ecology, 2015, 75:129-137.
Caporaso J G, Lauber C L, Walters W A, et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at adepth of millions of sequences per sample[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011, 108(Supplement 1): 4516-4522.
Klindworth A, Pruesse E, Schweer T, et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies[J]. Nucleic Acids Research, 2013, 41(1): e1-e1.
Parada A E, Needham D M, Fuhrman J A. Every base matters: assessing small subunit rRNA primers for marine microbiomes with mock communities, time series and global field samples[J]. Environmental Microbiology, 2016, 18(5): 1403-1414.
Walters W, Hyde E R, Berg-Lyons D, et al. Improved bacterial 16S rRNA gene (V4 and V4-5)and fungal internal transcribed spacer marker gene primers for microbial community surveys[J]. mSystems, 2016, 1(1): e00009-15.
本期校稿：卢瑟菌 李小圆
本期排版：李小圆
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